7月28日，克隆犬“龍龍”出生滿兩個月了。“龍龍”一出生就不簡單，因為它是中國首例完全自主培育的體細(xì)胞克隆犬，更是世界首例基因編輯克隆犬。該成果由生物院賴良學(xué)研究員帶領(lǐng)希諾谷公司科研團(tuán)隊及廣州生物院實驗室團(tuán)隊完成。6月底，公安部南昌警犬基地將“龍龍”的血液樣本，與另一只比格犬“蘋果”進(jìn)行DNA檢測發(fā)現(xiàn)，“龍龍”與“蘋果”同一認(rèn)定幾率大于99.99%，但排除與代孕母犬親子關(guān)系。同時，中國科學(xué)院廣州生物醫(yī)藥與健康研究院(簡稱生物院)賴良學(xué)研究員團(tuán)隊，對“龍龍”與“蘋果”APOE基因進(jìn)行鑒定發(fā)現(xiàn)，其基因敲除方式也完全一致。

　　“蘋果”耳朵上被取下極小塊的皮膚組織

　　2016年底，世界首例動脈粥樣硬化疾病模型犬“蘋果”，在北京希諾谷公司誕生，它的名字源于A POE基因的諧音。研究團(tuán)隊的主要青年技術(shù)骨干王曉民介紹，“蘋果”出生后，研究人員從其耳朵上取下極小塊的皮膚組織，通過細(xì)胞體外培養(yǎng)，保存在液氮罐中，留待后續(xù)發(fā)力。“任何植物或動物的一個細(xì)胞，都包含了整個生物體的遺傳信息，哪怕只是極小塊的皮膚組織，通過細(xì)胞增殖后，都可以做無數(shù)次的實驗。”

　　摸清犬的發(fā)情排卵規(guī)律，團(tuán)隊拿到了它的成熟卵母細(xì)胞，然后進(jìn)行克隆胚胎的構(gòu)建。其過程是，先去掉卵母細(xì)胞的細(xì)胞核，“遺傳物質(zhì)都在細(xì)胞核中”，而后“蘋果”的體細(xì)胞從液氮中復(fù)蘇，經(jīng)電融合，將其細(xì)胞核轉(zhuǎn)入去核的卵母細(xì)胞，再激活重構(gòu)的卵母細(xì)胞，克隆胚胎即構(gòu)建完備。下一步就是把克隆胚胎移植到代孕的子宮，30天后，給狗做B超，檢測顯示，“代孕媽媽”懷孕了。又過一個月，2017年5月28日，世界首例基因敲除體細(xì)胞克隆犬“龍龍”誕生。

　　前后進(jìn)行了100多次實驗

　　最終攻克電融合等系列難題

　　犬不同于小鼠、牛、羊等生物，它很特殊，一直以來被認(rèn)作是世界上最難被克隆的動物之一。2005年，世界首例體細(xì)胞克隆犬“史努比”在韓國誕生。此后，犬體細(xì)胞克隆技術(shù)就一直掌握在韓國人手中，從未被其他國家突破。“龍龍”的誕生，也標(biāo)志著中國成為繼韓國之后第二個獨立自主掌握犬體細(xì)胞克隆技術(shù)的國家，同時，首次實現(xiàn)犬基因敲除體細(xì)胞克隆。

　　除了摸清發(fā)情規(guī)律，獲得成熟的卵母細(xì)胞外，最難的是電融合。犬卵母細(xì)胞中富含脂類物質(zhì)，顏色較深，黏性很大，顯微操作較困難，電融合的效率不高，“團(tuán)隊一直交流，不斷調(diào)整參數(shù)去試，最終才成功。”王曉民說。“前前后后共進(jìn)行了100余次實驗。”王曉民說，實驗最終攻克了電融合等一系列難題。“龍龍”的外觀跟“蘋果”看起來一樣，但因為“龍龍”還小，目前在動脈粥樣硬化疾病上，尚沒有明確的表型。

　　科普

　　為何克隆犬此前鮮有聞之

　　21年前，克隆羊“多莉”誕生，震動世界。而后，克隆牛、克隆豬等克隆動物，陸續(xù)誕生，但對克隆犬，此前卻鮮有聞之?克隆犬的首要難題是成熟卵母細(xì)胞的獲取?？寺“ㄈ齻€主要的技術(shù)環(huán)節(jié)，一是成熟卵母細(xì)胞的獲取及卵母細(xì)胞去核，二是克隆胚胎制備，三是克隆胚胎的移植。

　　成熟卵母細(xì)胞的獲取有兩個途徑：體外成熟培養(yǎng)和體內(nèi)輸卵管沖卵獲取。比如豬、牛、羊等動物，可以去屠宰場獲取被屠宰牲畜的卵巢，從卵巢的卵泡中取出未成熟的卵母細(xì)胞，經(jīng)體外成熟培養(yǎng)后，便可用于后續(xù)的體細(xì)胞克隆。犬卵母細(xì)胞從卵泡中排出后處于G V期，是未成熟的卵子，需在輸卵管中停留48-72小時達(dá)到成熟期(MⅡ)，而體外成熟培養(yǎng)效率極低，幾乎無法滿足克隆需求，因此只能通過體內(nèi)成熟的方法，獲取體內(nèi)成熟卵子，用于犬的體細(xì)胞克隆。

　　犬的發(fā)情周期長達(dá)幾個月，發(fā)情期持續(xù)10-15天，但排卵后從卵母細(xì)胞成熟到老化的間隔時間較短。因此，獲取成熟且質(zhì)量好的卵母細(xì)胞窗口期非常短。這就要求準(zhǔn)確判斷犬的排卵及卵子成熟的時間，才能獲得處于理想狀態(tài)的卵子用于克隆胚胎的制備。而一旦錯過卵子成熟的時間，下次排卵，就要等半年甚至一年。一只狗平均排卵7-8枚，“取得早沒成熟，過晚又老化了。甚至同一批卵母細(xì)胞，有的成熟早，有的晚。”

　　釋疑

　　克隆犬可以用來做什么?

　　王曉民說，目前在韓國，克隆犬有多種用途，首先是克隆優(yōu)良工作犬，如搜救犬，緝毒犬，導(dǎo)盲犬等，“這些犬有些特殊的技能，跟遺傳因素影響比較大，而訓(xùn)練起來又非常難。”據(jù)報道顯示，9·11事件中的“英雄”搜救犬，就曾被克隆出來?？寺∫灿脕肀Ｗo(hù)瀕危犬科動物，如紅狼，草原胡狼，灰狼等。建立疾病模型后，再“復(fù)制粘貼”，克隆技術(shù)還能夠制造更多的疾病模型犬，用于人類疾病的研究。

　　此外，犬是非常理想和成熟的實驗動物，與人類在營養(yǎng)代謝、生理解剖等方面有很多相似點，而且狗溫順，配合度高，“比豬、猴子等動物都更聽話。”賴良學(xué)說，目前團(tuán)隊在帕金森、自閉癥、糖尿病等方面都有研究，如果有需要，也可以建立狗疾病模型，進(jìn)行藥物篩選。王曉民說，目前國內(nèi)克隆動物主要用于科學(xué)研究，包括疾病模型、藥物研發(fā)、瀕危物種保存等。賴良學(xué)說，在“龍龍”出生后，不少警犬基地就打來電話，希望進(jìn)行合作。警犬珍貴，進(jìn)口又較貴，團(tuán)隊后續(xù)也希望通過將基因編輯技術(shù)與克隆技術(shù)相結(jié)合，批量培育嗅覺、奔跑能力更強的警犬。

　　“復(fù)制版”寵物狗會保留原來的記憶嗎?

　　對愛養(yǎng)寵物的人來說，最值得期待的就是克隆寵物犬了。有報道顯示，韓國有公司推出寵物克隆服務(wù)，每只克隆小狗的價值約為10萬美元，價格不菲。“動物體細(xì)胞克隆研究相對較寬松，而人體細(xì)胞克隆研究是嚴(yán)格禁止的，包括早期體細(xì)胞克隆胚胎等。”王曉民說。

　　克隆狗還留有原來的記憶嗎?性格愛好是否一致?王曉民說，克隆犬從基因?qū)用鎭碚f，和它的原始版本并無二致，但它的成長仍有后天因素的影響，性格、愛好、記憶，這些因素不可遺傳，被克隆狗的記憶只屬于自己，克隆狗也會有只屬于自己的記憶。王曉民查閱資料發(fā)現(xiàn)，韓國方面有對克隆狗的健康狀況做過研究，包括克隆狗的體重、體形、顱骨尺寸、骨板、血常規(guī)等的檢測，與正常狗相比沒有差別?？寺〉墓范己芙】?，沒有出現(xiàn)一些重大疾病，壽命與正常狗也相一致。